约在魏武侯九年（前387年）后，吴起遭幸臣王错（一说公叔痤，但被认为是误记）谗害，受到武侯的猜疑，于是离开魏国，向南投奔楚国。
楚悼王得到吴起后，任命他为北部重镇宛城的守，负责防御韩、魏。吴起积极巡视下辖县，悉心治理宛郡。一年后，悼王升授吴起为令尹。担任令尹后的吴起在楚国国内进行了大刀阔斧的改革，具体措施有：
制定法律并将其公布于众，使官民都明白知晓。
凡封君的贵族，已传三代的取消爵禄；停止对疏远贵族的按例供给，将国内贵族充实到地广人稀的偏远之处。
淘汰并裁减无关紧要的官员，削减官吏俸禄，将节约的财富用于强兵。
纠正楚国官场损公肥私、谗害忠良的不良风气，使楚国群臣不顾个人荣辱一心为国家效力。
统一楚国风俗，禁止私人请托，改“两版垣”为四版筑城法，建设楚国国都郢。
经过吴起变法后的楚国国力强大，向南攻打百越，将楚国疆域扩展到洞庭（今江西南部）、苍梧郡（今湖南、广西）一带，加强了中原与岭南在经济、文化上的交流；同时巩固了楚国对所占的陈、蔡故地的统治（一说是为夺回被韩魏侵占的部分陈蔡之地；还有一说是陈蔡已复国，此举意在蚕食陈国和蔡国土地）。
楚悼王二十一年（前381年），在吴起的指挥下，楚军北上援助遭魏国攻击的赵国，与魏军大战于州（今河南温县东北）西。楚军穿越梁门（位于大梁西北的关塞），驻军林中（位于梁门以北），饮马于黄河，切断魏国河内郡与首都安邑（今山西省夏县）的联系。赵国则借助楚国的攻势，火攻棘蒲（今河北魏县南），攻克黄城（今河南内黄），楚、赵两国大败魏军。此时，诸侯都畏惧楚国的强大，这是吴起在楚变法后所取得的大胜利。
但是，吴起在变法中，曾遭到楚国旧贵族的反对，史称贵人“皆甚苦之”。甚至连改变“两版垣”的简陋建筑方法也“见恶”。还在出行巡视时遇到大臣屈宜臼的指责。尽管吴起坚持变法，取得了成效，但他进行的种种措施触犯了旧贵族的利益，招致了他们的怨恨，为自己埋下了杀身之祸。
楚悼王二十一年（前381年），就在楚军于前线接连获胜之际，楚悼王去世。吴起前往治丧处，被心怀不满的楚国贵族们用箭射伤。吴起大叫着说：“我让你们看看我是如何用兵的。”他拔出箭逃到楚悼王停尸的地方，将箭插在楚悼王的尸体上，马上喊道：“群臣作乱，谋害我王。”贵族在射杀吴起的同时也射中了楚悼王的尸体。
按照楚国法律的规定，“丽兵于王尸者”，将被诛灭三族。新即位的楚肃王根据此规定，命令尹把射杀吴起时射中楚悼王尸体的人全部处死，受牵连被灭族的有七十多家。《吕氏春秋》认为：“吴起之智可谓捷矣。”吴起的尸身也被处以车裂肢解之刑。吴起死后，他在楚国的变法宣告失败。
唐朝上元元年（760年），唐肃宗追封姜尚为武成王，以历代良将“为十哲象坐侍”于武成王庙，吴起便是其中之一。及至宋代宣和五年（1123年），宋室依照唐代惯例，仍以古代的七十二位名将从祀武成王庙，其中包括吴起。同时，吴起还被追封爵位为广宗伯。在宋明时期成书的《十七史百将传》《广名将传》等兵书，亦将吴起列于其中。
在楚国时，作为令尹的吴起全力辅佐楚悼王进行变法。他变法的原则大致有三条：
一是“均楚国之爵而平其禄”。具体做法是取消封君（贵族）三世以后子孙的“爵禄”，降低官吏的俸禄；
二是“损其有余而继其不足”。即剥夺一些旧贵族的“有余”来补充新兴地主的“不足”，逐步废除旧贵族的世禄制；
三是“厉甲兵以时争于天下”，即加强对军队训练，在战争中“进有重赏，退有重刑”。用一支能征善战的强大的军队争夺天下。
吴起确立变法原则之后，在楚国大刀阔斧地进行了改革：
为了能自上而下加以贯彻，吴起首先主张“明法审令”，厉行“使私不害公，谗不蔽忠，言不敢苟同，行不敢苟容，行义不顾毁誉”的“法治”；
其次，“废公族疏远者”，也就是废除那些非楚王直系的贵族的政治地位和经济保障，同时裁减群臣的俸禄，精简“无能”“无用”的官员，裁撤不急之官，把节省下来的开支用于“抚养战斗之士，要在强兵”。通过这一方略，为楚国的“强兵”之路提供了有力的经济保障；
再次，强兵以“破横散纵”。在外交上，吴起以楚国军事实力的崛起替代纵横家游说之言。换言之，建立在“强兵”基础上的楚国外交，不再需要纵横家的调停和斡旋。因此他“破横散（纵），使驰说之士无所开其口”，以此禁止纵横家游说，防止内外勾结。吴起的强兵之策，建立在他擅长的军事谋略上，当是其长项。
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