王朝的分裂。
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1554年至1556年间，查理五世逐渐将哈布斯堡帝国和哈布斯堡家族分为一个西班牙的主要支系和一个德奥的分支。
他的所有退位仪式都在布鲁塞尔的库登贝格宫进行。
首先，他在1554年7月25日将西西里岛和那不勒斯的王位（后者是教皇的封地）以及米兰公国的皇室权力让给了他的儿子菲利普。
菲利普在1540年和1546年就已经秘密获得米兰的封地，但直到1554年，皇帝才公开宣布这一决定。
在退位西西里岛和那不勒斯后，菲利普于10月2日被教皇尤利乌斯三世授予那不勒斯王国，并于11月18日获得西西里王国的封地。
最着名的也是唯一一次公开的退位发生在一年后，即1555年10月25日。
当时，查理在荷兰各省的省议会（重聚于四十年前他在马克西米利安皇帝面前获得解放的伟大大厅）上宣布退位，将这些领土让给他的儿子菲利普，并表示他打算辞去所有职位，退休到一个修道院。
仪式上，因痛风而饱受折磨的查理五世依靠着他的顾问威廉·无畏的肩膀，流着泪发表了辞职演说：
“当我十九岁时……我决心竞选皇帝的皇冠，并不是为了增加我的财富，而是为了更积极地致力于德国及我的其他领土的福祉……
希望能够为基督教民族之间带来和平，并团结他们的力量以扞卫天主教信仰，抵御奥斯曼帝国……
我几乎达到了目标，但法国国王和一些德国诸侯的进攻让我再次被迫拿起武器。
对我的敌人，我尽力而为，但战争的成功在于上帝的手中，祂随心所欲地赐予胜利或夺走胜利……
我必须承认，我常常误导自己，无论是因为年轻时的无知，还是因为成年后的骄傲，或是其他人性上的弱点。
然而，我向你们声明，我从未故意或乐意地行不义之事……
如果这种行为仍然被公正地归咎于我，我郑重地向你们保证，我是出于无知，并非出于我的本意。
因此，我恳请在座的各位，以及那些缺席的人，原谅我在这方面所犯的错误。”
他以提及自己的旅行结束了演说：十次前往低地国家，九次前往德国，七次前往西班牙，七次前往意大利，四次前往法国，两次前往英格兰，以及两次前往北非。
他的最后一句公开话是：“我的一生就是一场漫长的旅程。”
在没有任何盛大仪式的情况下，查理于1556年完成了他的退位。
1556年1月16日，他将西班牙及其在美洲的西班牙帝国交给了菲利普。
1556年8月27日，他将神圣罗马帝国皇帝的位子让给了他的弟弟斐迪南，斐迪南于1531年被选为罗马国王。
皇帝的继承在1558年时被法兰克福集会的选侯们认可，1559年时被教皇认可。
皇帝的退位还标志着斐迪南在奥地利领土上的法律和实质统治的开始，自1521-1522年起他便以查理的名义治理这些领土，并自1526年起附属于匈牙利和波希米亚。
据学者分析，查理决定退位的原因多种多样：
1555年确认的德国宗教分裂；
西班牙财政状况的恶化，在他统治结束时已经因通货膨胀而破产；
意大利战争的复苏，法国国王亨利二世的攻击；
奥斯曼帝国在地中海和中欧的不断进逼；
以及他健康状况的恶化，尤其是痛风的发作，比如迫使他推迟重新夺回梅斯城的企图，而他最终在该地战败。
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查理之死。
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1556年9月，查理离开低地国家，和他的姐妹玛丽·匈牙利和埃莉诺·奥地利一起乘船前往西班牙。
他于1557年抵达极端地区的尤斯特修道院。
他继续广泛通信，并对帝国的局势保持关注，同时饱受严重的痛风折磨。
他独自生活在一个隐蔽的修道院里，四周环绕着提香的画作，墙上挂满了钟表，许多历史学家认为这些钟表象征着他的统治和他缺乏时间。
1558年8月，查理病重，后来在21世纪被揭示为患上了疟疾。
他于1558年9月21日凌晨去世，享年58岁，手中握着他妻子伊莎贝拉去世时所握的十字架。
查理去世后，他的帝国内举行了大量的纪念活动，包括在墨西哥和秘鲁。
为皇帝的灵魂安排了大约30,000场弥撒，并分发了他为赎回囚犯、贫穷处女和乞丐而准备的30,000个杜卡特金币。
但他因长期战争而欠下巨额债务，远远超出手头资金，他的继承者们花了几十年才偿还完毕。
查理最初被安葬在尤斯特修道院的礼拜堂，但他在遗嘱中附加了一份遗嘱附录，请求建立一个新的宗教基金会，他将与伊莎贝拉一起重新安葬。
1559年他回到西班牙后，他们的儿子菲利普承担起了实现父亲愿望的任务，创立了圣洛伦索·埃尔埃斯科里亚尔修道院。
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